La biologie synthétique vise à concevoir des systèmes biologiques pour des applications dans les domaines de la santé, de la biofabrication et de l’environnement. Cependant, des défis persistent en raison du nombre limité d’éléments génétiques bien caractérisés, des interactions indésirables et de la nécessité d’explorer de nouvelles fonctions biologiques. Pour relever ces défis, l’équipe SyBER utilise des approches multidisciplinaires, y compris des méthodologies d’ingénierie des génomes de pointe, l’évolution adaptative en laboratoire, le phénotypage à haut débit in vivo et basé sur le lysat, et la modélisation, à travers trois axes de recherche complémentaires :
À travers les trois axes de recherche, nous contribuons également à l’identification de nouvelles fonctions et au développement de technologies destinées à servir des applications et des projets futurs.
La variation de l’abondance de la machinerie cellulaire en fonction du taux de croissance, ainsi que les mécanismes de régulation spécifiques aux conditions, affectent l’expression et le bruit des gènes, ce qui pose des problèmes pour la conception de circuits synthétiques.
Terminaison de la transcription chez les bactéries Gram-positives. Le facteur de terminaison de la transcription Rho est connu pour supprimer la transcription omniprésente, principalement antisens, et nous avons montré qu’il agit comme un régulateur global déterminant le destin cellulaire chez B. subtilis [10.1371/journal.pgen.1006909]. Dans le cadre du projet CoNoCo financé par l’ANR (ANR-18-CE12-0025 ; collab. avec C Condon, Paris, M Boudevilain, Orléans et P Romby, Strasbourg), nous avons étendu nos recherches sur la fonction de Rho à l’ensemble des bactéries Gram-positives. Nos recherches ont révélé que la manipulation de l’expression de Rho, par inactivation ou surproduction, influence divers programmes de développement, y compris la motilité, la formation de biofilms et la sporulation [10.1101/2023.12.01.569620]. En outre, nous avons découvert que les cellules B. subtilis de type sauvage ont besoin de niveaux réduits de Rho pendant la transition vers la phase stationnaire pour initier et exécuter efficacement le programme de sporulation, soulignant son importance critique dans la formation des spores, la germination et la viabilité bactérienne [10.1371/journal.pgen.1010618].
Décomposition de l’expression génétique. Le bruit de l’expression génétique et les régulations dépendant du taux de croissance empêchent de prévoir le comportement des circuits [10.1016/j.bbagrm.2020.194502]. Par exemple, il est reconnu que les procaryotes peuvent ajuster le bruit d’expression des gènes indépendamment de l’abondance moyenne des protéines en modulant les niveaux relatifs de transcription et de traduction. Nous avons décomposé l’expression des gènes en éléments génétiques bien caractérisés (par exemple, loci, régions -35/-10, sites de transcription +1, séquences RBS, etc.) et assemblé une bibliothèque d’une centaine de constructions synthétiques pour contrôler l’expression de la GFP. Notre analyse a révélé que le bruit d’expression est également sensible aux variations des taux de transcription ou de traduction dues à la prévalence du bruit extrinsèque, ce qui rend difficile le contrôle indépendant de l’abondance moyenne et du bruit. Ceci a des implications significatives pour l’évolution du génome et l’ingénierie biologique [10.1126/sciadv.abc3478]. La bibliothèque a été analysée dans diverses conditions de croissance et les données sont actuellement intégrées dans un modèle personnalisé. En fin de compte, nous visons à redéfinir l’architecture fondamentale de l’expression des gènes chez les bactéries et à promouvoir la conception rationnelle de séquences régulatrices pour prédire l’abondance des protéines en fonction des conditions de croissance par le biais de l’ingénierie inverse.
Les circuits synthétiques sont souvent confrontés à des dysfonctionnements dus à des interactions involontaires avec le système hôte. Pour stimuler l’innovation, la construction de châssis bactériens rationalisés est prometteuse. Le développement de nouveaux outils d’ingénierie pour construire la prochaine génération de châssis bactériens est essentiel à cette entreprise.
Châssis bactérien synthétique pour revisiter l’ensemble minimal de gènes bactériens. En utilisant une approche ciblée, nous avons supprimé de grandes régions dispensables dans le génome de B. subtilis, ce qui a permis d’obtenir une bibliothèque de 298 souches dont les génomes ont été réduits jusqu’à 1,48 Mb. Le phénotypage à haut débit a révélé une diminution de l’aptitude cellulaire et l’émergence d’interactions synthèse-maladie, ainsi que de nouveaux phénotypes tels qu’une résistance significativement accrue (>300 fois) à l’agent endommageant l’ADN, la mitomycine C, et une mutagénèse spontanée réduite (de 100 fois) par rapport au type sauvage. Bien que les mécanismes à l’origine de ces phénotypes restent obscurs, nous avons exploité la faible évolutivité dans une stratégie d’ingénierie impliquant des cycles d’évolution adaptative en laboratoire sous mutagénèse induite [10.1093/nar/gkad145]. Cependant, cette approche de réduction du génome s’est avérée longue et peu adaptée à des développements rapides. Dans le cadre du projet Bacillus 2.0 financé par l’ANR (ANR-18-CE44-0003 ; collab. avec C Lartigue, Bordeaux), nous avons initié la construction de SynBsu2.0, un génome de 1 Mb dérivé de B. subtilis, par assemblage in vitro de régions synthétiques et essentielles, et par clonage dans la levure. Nous avons également développé la méthode CReasPy-Fusion pour le clonage simultané et l’ingénierie CRISPR de génomes de la taille d’une mégabase dans la levure par la fusion de cellules bactériennes avec des sphéroplastes de levure [10.1021/acssynbio.3c00248]. Ces stratégies visent à faciliter la conception, la construction et l’ingénierie rapides de génomes synthétiques en vue d’une rétro-transplantation ultérieure dans des protoplastes de B. subtilis.
Développement d’outils d’ingénierie multiplex. Les systèmes CRISPR, tels que Cas9, posent des problèmes lorsqu’ils ciblent le chromosome de la bactérie hôte, ce qui limite le développement de stratégies d’ingénierie génomique multiplex basées sur CRISPR. Pour résoudre ce problème, nous avons créé des souches capables d’héberger un système CRISPR contrôlable, étroitement régulé par une protéine anti-CRISPR inductible, AcrIIA4. Il s’agit du premier cas de transformation et de contre-sélection utilisant un système killswitch pré-intégré ciblant le génome bactérien. Nous avons également développé et validé une méthode d’ingénierie in vivo très efficace pour les génomes de phages de bactéries Gram-positives à l’aide de Cas9.
L’orthogonalité et les nouvelles fonctionnalités sont essentielles pour les applications futures de la biotechnologie.
Transcription orthogonale pour la production de protéines. Nous avons mis en œuvre deux circuits synthétiques dans B. subtilis fonctionnant en synergie, conduisant à : i) une transcription orthogonale à celle de B. subtilis pour produire une protéine d’intérêt, et ii) un arrêt inductible de la transcription native de l’hôte pour rediriger toutes les ressources disponibles vers la machinerie de transcription orthogonale. Cette transcription orthogonale et invasive a entraîné une augmentation significative de la production de protéines par rapport aux systèmes de production actuels [brevet PCT/EP2024/055294].
L’évolution continue assistée par les phages (PACE) pour créer de nouvelles fonctions. Dans la nature, les fonctions biologiques sont constamment adaptées ou créées par les effets combinés des mutations aléatoires et de la sélection. La PACE, décrite uniquement pour E. coli à l’heure actuelle, est une approche appropriée qui imite ce processus en laboratoire (appelé évolution dirigée) pour modifier une fonction vers une propriété souhaitée. Elle repose sur un assemblage astucieux de constructions génétiques de sorte que l’aptitude du phage soit liée à la propriété souhaitée par un effet de trans-complémentation. L’évolution dirigée est ensuite réalisée en propageant la population de phages continuellement alimentée par une culture de bactéries naïves. Dans le cadre du projet BioBrickEvolver financé par l’ANR (ANR-18-CE43-0002 ; collab. avec P Nicolas, Jouy-en-Josas et P Tavares, Gif-sur-Yvette), nous avons initié le développement d’un système PACE utilisant B. subtilis et le phage SPP1. Tout d’abord, nous avons construit des mini-bioréacteurs modulaires et connectés pour la culture de la bactérie et du phage [divulgation de l’invention], ainsi qu’une souche de châssis B. subtilis multi-supprimée incapable de produire un biofilm et stable jusqu’à 1000 générations en culture continue. Ensuite, nous avons développé des méthodologies d’ingénierie du génome des phages basées sur l’assemblage in vitro et la transfection d’ADN synthétique pour récupérer les mutants SPP1. En utilisant cette méthodologie, nous avons construit les phages nécessaires à la PACE, ainsi que des phages mutants à gène unique. L’aptitude de 36 mutants a été caractérisée pendant l’infection de B. subtilis, révélant qu’environ 25 % des gènes de phage étaient (presque) essentiels pour la propagation du phage. Enfin, pour accélérer l’évolution, nous avons généré des hypermutateurs conditionnels présentant une large gamme de taux de mutation et des profils de mutation contrastés. De manière très intéressante, nous avons montré qu’un inconvénient inhérent à la relecture est de fausser les taux d’erreur nets de la polymérase en amplifiant les biais intrinsèques dans la sélectivité des nucléotides [10.1101/2023.12.29.573609]. Les trois composants sont actuellement intégrés pour réaliser une première expérience PACE.
